今天喆圖小編來說說在實(shí)驗(yàn)中,為了獲得純的重組質(zhì)粒DNA,需要允許外源DNA分子進(jìn)入的細(xì)胞。經(jīng)過一些特殊方法處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的細(xì)胞,即感受態(tài)細(xì)胞。
那么感受態(tài)如何制備,喆圖小編就來給大家說一說它的基本制備步驟:
①、從37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-20 h的平板中挑取一個單菌落(直徑2-3 mm),轉(zhuǎn)到一個含有100 ml LB或SOB培養(yǎng)基的1L燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養(yǎng)3 h。一般經(jīng)驗(yàn),1 OD600約含有大腸桿菌DH5α 109 個/mL。
②、將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個無菌、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50 ml聚丙烯管中,在冰上放置10 min,使培養(yǎng)物冷卻至0℃。
③、于4℃用Sorvall GS3特頭以4 100 r/min離心10 min,以回收細(xì)胞。
④、倒出培養(yǎng)液,將管倒置1 min以使MAX后的痕量培養(yǎng)液流盡。
⑤、每50 ml初始培養(yǎng)液用30 ml預(yù)冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2,20 mmol/L CaCl2)重懸每份細(xì)胞沉淀。
⑥、于4℃用Sorvall GS3轉(zhuǎn)頭以41 00 r/min離心10 min,以回收細(xì)胞。
⑦、倒出培養(yǎng)液,將管倒置1 min以使MAX后的痕量培養(yǎng)液流盡。
⑧、每50 ml初始培養(yǎng)物用2 ml用冰預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重懸每份細(xì)胞沉淀。
⑨、此時可以用新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞直接做轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),也可以將細(xì)胞凍存于- 40℃的低溫保存箱中。
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